Самый мелкий из грызунов и одно из самых мелких млекопитающих на Земле (меньше её только землеройки - крошечная бурозубка и карликовая белозубка). Длина тела 5,5-7 см, хвоста - до 6,5 см; весит 7-10 г. Хвост очень подвижный, хватательный, способен обвиваться вокруг стеблей и тонких сучьев; задние лапы цепкие. Окраска заметно ярче, чем у домовой мыши. Окраска спины однотонная, буровато-охристая или рыжеватая, резко отграниченная от белого или светло-серого брюшка. В отличие от других мышей мордочка у мыши-малютки тупая, укороченная, уши небольшие. Северные и западные подвиды окрашены темнее и рыжее. Мышь-малютка населяет южную часть лесной и лесостепную зону, по долинам рек проникая почти до Полярного круга. В горах поднимается до 2200 м над уровнем моря (центральная часть Большого Кавказского хребта). Предпочитает открытые и полуоткрытые местообитания с высоким травостоем. Наиболее многочисленна на высокотравных лугах, включая пойменные, на субальпийских и альпийских лугах, на сплавинах, среди редких кустарниковых зарослей, бурьянной растительности на пустошах, на залежных землях, сенокосах и межах. В Италии и Восточной Азии встречается по рисовым чекам.

Активность круглосуточная, прерывистая с чередованием периодов кормления и сна. Мышь-малютка чувствительна к перегреву и избегает прямых солнечных лучей. Характерная поведенческая особенность мыши-малютки — передвижение по стеблям растений в поисках корма, а также местоположение летнего гнезда. Мышь сооружает на травянистых растениях (осока, тростник) и низкорослых кустарниках круглые гнёзда диаметром 6-13 см. Гнездо располагается на высоте 40-100 см. Оно предназначено для выведения потомства и состоит из двух слоев. Наружный слой состоит из листьев того же растения, к которому крепится гнездо; внутренний - из более мягкого материала. Обычные жилые гнёзда устроены проще. Осенью и зимой мыши-малютки зачастую перебираются в простые норы, в стога и скирды, порой в человеческие постройки; прокладывают подснежные траншейки. Однако в отличие от других мышей мыши-малютки в таких условиях не размножаются, принося потомство только летом в надземных гнёздах. В спячку не впадают.

Отмечается круглый год, обычна, населяет разнообразные биотопы, но чаще всего встречается в полевых и луговых стациях.